可溶性 Fab クローンの遺伝子型別機能スクリーニングにより、

Scientific Reports volume 13、記事番号: 13107 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

モノクローナル抗体 (mAb) とそのフラグメントは、治療、診断、基礎研究で広く使用されています。ファージディスプレイなどのディスプレイ方法はハイスループットを提供しますが、個々の抗体の親和性は可溶性フォーマットで正確に測定する必要があります。当社は、階層型インデックスを備えた次世代シーケンシング (NGS) を採用することで、合計 9,216 個の可溶性個別抗原結合フラグメント (Fab) クローンから遺伝子型特定された機能データを提供できるスクリーニングプラットフォームを開発しました。全長のペア可変ドメイン配列 (VL-VH) は機能スクリーニングデータにリンクされており、変異の影響を詳細に分析できます。このプラットフォームは、4 つのファージディスプレイ選択 scFv/Fab スクリーニングプロジェクトと 1 つの部位飽和 VH アフィニティー成熟プロジェクトに適用されました。遺伝子型別機能スクリーニングにより、デング熱ウイルス非構造タンパク質 1 (NS1) 血清型 2 を認識する Fab 49A3 の VH ドメインにおける親和性を向上させる変異の同定が同時に可能になり、親和性を低下させることなく野生型から変更できない VH 残基の位置についての情報が得られました。遺伝子型に基づいた同定により、この分野では見落とされがちな現象である、単一点スクリーニングデータに固有のクローン内シグナル分散の程度が明らかになりました。さらに、遺伝子型別スクリーニングにより、さらなる研究のための同一遺伝子型の重複した選択が排除され、ファージディスプレイ選択の成功とスクリーニングされたレパートリーに残っているクローン多様性を評価するための新しい分析ツールが提供されました。

組換え抗体工学は、バイオテクノロジーの分野における成功事例です。モノクローナル抗体 (mAb) とそのフラグメント (一本鎖可変フラグメント (scFv) や抗原結合フラグメント (Fab) など) は、治療法、診断法、基礎研究のツールとして広く使用されています1。これらの用途のための新規標的分子が発見されるにつれ、高い親和性、特異性、および望ましい物理化学的特性を備えた新規または改良されたバインダーが必要とされています。

抗体フラグメントのサイズが小さく、Fc ドメインがないため、フルサイズの IgG と比較して、より優れた組織浸透 2,3 や、体外診断アッセイにおける干渉の可能性が小さい 4 など、いくつかの利点があります。抗体工学の観点から見ると、抗体フラグメントの構造が単純であることの主な利点は、大腸菌での発現が経済的かつ容易であり、ファージディスプレイでの使用が可能になることです5。高度な組換え抗体遺伝子ライブラリー技術 6,7 とハイスループットディスプレイ法を組み合わせることで、多種多様な標的に対するバインダーを濃縮する効率的な方法が提供されます 8。

ディスプレイ方法はハイスループットを備えていますが、個々のバインダーの親和性と特異性は、可溶性フォーマットで多数の個々の抗体をスクリーニングすることによって評価する必要があります。ファージに表示された抗体フラグメントが可溶性フォーマットに変換された後、特異性の損失がいくつかの研究で報告されています9,10。これは、ディスプレイのための scFv の最も一般的な融合パートナーである pIII タンパク質からのサポートを失った後の scFv の立体構造の変化によって説明される可能性があります 10。 scFv から IgG 形式への直接変換後の親和性の喪失に関する報告もあり 11,12、発見された抗体の適用分野が大幅に制限されています。さらに、scFv の意図しない多量体化は、アビディティ効果によるより強い結合をもたらしますが、これはパニングや可溶性スクリーニングでは望ましくありません 13,14。しかし、Fab は一般にアフィニティーアッセイの理想的なスクリーニング形式である単量体分子と考えられており、複数の Fab が表示されたファージ粒子の存在を除外することはできませんが、結合力効果による濃縮のリスクは Fab の方が scFv よりも低いです。ファージライブラリー１３．信頼性の高い親和性推定に加えて、可溶性スクリーニングにより、良好な発現レベルを持つクローンの同定が可能になります。

3) among the phage display selected libraries. Among genotypes encountered at least three times in the screening campaign, 66.7% did not bind to the SpyCatcher-antigen (S/B < 3), whereas, of the remaining genotypes, 28.9% showed S/B-ratio both above and below the set threefold threshold ratio, and 4.4 % were positive (S/B > 3) in all instances (6.7% if calculated by S/B > 2). On the contrary, anti-DARPin library was over enriched in relation to the number of clones screened, with only 76 unique genotypes, 43% of which were represented between 2 and 331 times with a standard deviation (SD) of 47. Three genotypes, including one used as control, were present with 170 clones or more. The low number of unique clones in the anti-DARPin Fab repertoire is consistent with the selection scheme, as four rounds of Fab-phage selections were carried out with the anti-DARPin library in contrast to three with anti-SpyC library and one to two with anti-NP libraries. The genotype copy numbers per library are shown in Fig. 2b./p> 3) and distribution of functional screening data differed between the phage-derived screening projects. Despite undergoing 4 + 4 rounds of phage display, it appears that the anti-SpyCatcher library was not fully enriched and could have potentially benefited from an additional round of phage display selection or a reconsideration of the selection strategy. The selection campaign involved various antigens, including chemically biotinylated SpyCatcher, scFv-SpyCatcher, and in vivo biotinylated Spy- and SdyCatcher proteins, aiming to enhance binding towards the catcher rather than the SA-biotin linker. The insufficient enrichment is evidenced by the low number of identical genotypes in the screened set and a relatively low hit rate of 13%. Low hit rate can also be seen in the distribution of the functional signal data (Fig. 2), which is heavily bottom weighted. In the remaining three projects, the hit rates were higher and also the shared genotypes more abundant. In the case of the anti-DARPin library the selection could have been screened after the 3rd round instead of the 4th round of panning, as only a few genotypes were represented in the data, which also had a quite evenly distributed functional signal. NP-1 and NP-2 both come from the same Fab-converted phage library origin, but the functional data between them is very different, with NP-2 having more evenly distributed signals between clones. This was expected, as the last two selection rounds and assay formats were different. NP-2 Fabs were first bound on the wells, followed by addition of biotinylated antigen and detected with Eu-labeled streptavidin, whereas NP-1 Fabs were selected to bind antigen captured by the control Fab N1G1, and the presence of E. coli-expressed Fab-APs was detected with europium-labeled anti-alkaline phosphatase antibody./p>