レサズリン還元を用いた回虫 L3 の代謝活性の定量化

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 243 (2023) この記事を引用

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蠕虫感染症は人間にとって重要な公衆衛生上の問題であり、家畜や家畜の福祉にさらに大きな影響を与えます。 駆虫薬スクリーニングアッセイの現在の読み取り値は、段階の進行、移動、または運動性であり、主観的で手間がかかり、スループットが低い場合があります。 この研究の目的は、ブタの経済的関連性の高い寄生虫である回虫第 3 期幼虫 (L3) の代謝活動の変化を評価するために、レサズリンを使用した蛍光分析技術を適用および最適化することでした。

回虫 L3 は、6 ～ 8 週間の発育およびショ糖勾配濃縮卵から機械的に孵化しました。 レサズリン色素と A. suum L3 を 96 ウェル マイクロタイター プレートで滴定し、24 時間のインキュベーション後に蛍光分析によってレサズリン還元活性を評価しました。 蛍光顕微鏡検査を使用して、幼虫内のレサズリン還元部位の位置を特定した。 最後に、A. suum L3 を熱、メタノール、駆虫薬などのさまざまなストレス条件に曝露し、レサズリン還元活性を介して幼虫の代謝に及ぼす影響を調査しました。

我々は、非蛍光色素レサズリンが生きているA. suum L3内で蛍光レゾルフィンに還元され、培地中に放出されることを示す。 最適なアッセイパラメーターは、ウェルあたり 100 ～ 1000 L3、レサズリン濃度 7.5 μg/ml、37 °C/5% CO2 で 24 時間のインキュベーションです。 A. suum の L3 周囲の無傷の L2 鞘はレサズリンの取り込みを完全に防ぎますが、鞘のない L3 では、幼虫の中腸に沿って最も強い蛍光シグナルが観察されます。 L3 をメタノールまたは熱に曝露すると、レサズリン還元活性が徐々に低下します。 さらに、0.625 μM のイベルメクチン、5 μM のメベンダゾール、および 10 ～ 100 μM のチアベンダゾールに 24 時間曝露すると、幼虫の代謝活性がそれぞれ 55%、73%、および 70% ～ 89% 有意に低下しました。

まとめると、我々の結果は、代謝ストレス因子と駆虫薬の両方がA. suum L3のレサズリン還元活性を有意かつ再現性よく低下させ、提案されたアッセイをin vitroでA. suum L3の代謝活性を評価する高感度で使いやすい方法にすることを示しています。 。

消化管線虫の防除は主に人間と動物の両方に対する化学療法に依存しています。 しかし、治療と再感染の再発、現在利用可能な駆虫薬クラスの制限[49]、薬効低下の報告の増加、ベンズイミダゾールやイベルメクチンなどの最前線の駆虫薬に対する耐性の進化により、駆虫薬研究の重要性に対する認識が高まっている[19、22]。 、30、38]。 土壌伝播蠕虫（STH）に対する新薬の迅速な発見は、主に薬の有効性を評価するための客観的なハイスループットスクリーニング法の欠如によって妨げられています[1、20、47]。

幼虫の薬効を評価するために現在使用されている方法は、運動性と形態の顕微鏡による評価が主流です。 これらのアプローチは一般に、時間がかかり、労力がかかり、主観が入りやすいため、ハイスループットのスクリーニングには適していません。 xCELLigence System [40] や wMicroTracker System™ [24、37] などのデバイスは、Caenorhabditis elegans およびいくつかの寄生蠕虫種を用いたハイスループット薬物スクリーニングについて検証されていますが、読み取り値は完全に運動活動に限定されています。 したがって、新薬候補のスクリーニング時に複数のパラメーターに対処する組み合わせアプローチ、たとえば運動活動などの一般的な読み取り値と、電気生理学的活性や代謝活性などの推定上の作用機序の特定の読み取り値を組み合わせたアプローチが議論されています[12]。

運動性に加えて、線虫の生存率は、幼虫の段階で測定可能な生成物に変換される代謝活性の指示薬を使用して評価できます。 テトラゾリウム色素 3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT)、フルオレセインジアセテート (FDA)、パラニトロフェニルリン酸 (pNPP) など、さまざまな代謝指標が蠕虫に対してテストされています。 ) [34]、細胞透過性色素レサズリン。 レサズリンは、NADPH に依存したレサズリンのレゾルフィンへの還元に基づいており、広範囲の標的における哺乳動物細胞の増殖と細胞代謝をモニタリングするために広く使用されています [23]。 レサズリン還元アッセイは、これまで住血吸虫の成体種 [25、26]、第 4 期幼虫 (L4) および成虫の Trichuris muris [39] における薬物スクリーニングに適応されてきました。 私たちの知る限り、回虫種におけるレサズリン還元アッセイの可能性に関するデータは、次のとおりです。 寄生虫は存在しませんが、ヒトと豚の両方において世界中で最も一般的な STH の 1 つです [15、17、51]。