単一からのライブラリー調製のための高効率スキーム

Scientific Reports volume 13、記事番号: 13913 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

二本鎖 DNA からライブラリーを調製して配列決定する方法は十分に確立されていますが、一本鎖 DNA (ssDNA) からのライブラリー調製方法は十分に研究されていません。 さらに、既存の方法には効率と収率に限界があります。 したがって、我々は、ssDNA からのシーケンスライブラリー調製のための非常に効率的な手順を開発しました。 この方法では、ssDNA の最初のアダプター タグ付けは、最近報告したターミナル デオキシリボヌクレオチジル トランスフェラーゼ (TdT) 支援アデニレート コネクター媒介 ssDNA (TACS) ライゲーションを使用して実行されます。 アダプタータグ付き ssDNA を使用した相補鎖合成後、ワクシニア ウイルス トポイソメラーゼ I (VTopoI または TOPO) ベースのアダプター ライゲーションを介した 2 回目のアダプター タグ付けが実行されます。 提案された TACS-TOPO スキームでは、アダプターダイマーの分解、抑制、および除去のための追加のステップにより、24 pg の ssDNA サンプルからのアダプターダイマーフリーのシーケンスライブラリーの調製が実現します。 TACS-TOPO スキームは、50 μL のヒト血清から増幅を行わずにライブラリーを調製する無細胞 DNA 解析に適用することに成功しました。 修正された TACS-TOPO スキームも古代人骨から抽出された DNA に適用され、従来のライブラリー調製プロトコールを使用した場合よりも 2 ～ 8 倍のライブラリー収量が得られました。 VTopoIおよび二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターとの複合体を調製する手順も記載されています。 全体として、提案された TACS-TOPO スキームは、ssDNA の実用的で高感度な配列解析を容易にすることができます。

二本鎖 DNA (dsDNA) からのシーケンスライブラリー調製には多くの効率的な方法が利用可能ですが、一本鎖 DNA (ssDNA) については限られた方法が報告されています。 現在までに確立されている、ssDNA からのシーケンスライブラリー調製の主要な原則は 3 つだけです。 最初のアプローチには、ターミナル デオキシリボヌクレオチジル トランスフェラーゼ (TdT) を介した ssDNA の 3' 末端へのホモポリマー テーリングが含まれます。 次に、尾部をプライミング部位として使用して、標的 ssDNA を dsDNA に変換し、続いて T4 DNA リガーゼ 4 を使用して 2 番目のアダプターをタグ付けします。 TdT を介したライブラリー調製は非常に効率的であり、一部のメーカーはこの原理に基づいたライブラリー調製キットを提供しています。 ただし、長いテールは下流のシーケンス解析の障害となる可能性があります。

2 番目の方法は、RNA リガーゼによって触媒される ssDNA ライゲーションに基づいており、5' リン酸化アダプターを ssDNA の 3' 末端に結合します。 たとえば、Meyer のグループは、CircLigase II5,6 に基づく方法を確立しました。 アダプターライゲーション後、ssDNA は dsDNA に変換され、続いて T4 DNA リガーゼによる 2 番目のアダプタータグ付けが行われます。 RNA リガーゼは 2 つの ssDNA 分子を接続できますが、反応効率は数パーセント未満に限られます。 したがって、RNAリガーゼを使用したライブラリー調製の収量はかなり制限されます。

3 番目のアプローチでは、ssDNA ライゲーションに T4 DNA リガーゼを使用します7。 この方法では、一端に一本鎖のランダム六量体を備えた二本鎖アダプターが使用されます。 ランダム六量体がターゲット ssDNA の末端に適合的にハイブリダイズすると、アダプターの部分的に二本鎖になった末端のニックを T4 DNA リガーゼでシールできます。 このスプリントライゲーションベースの手順は ssDNA2.0 と呼ばれ、CircLigase II ベースの方法よりも優れた効率を示します 7。 RNA リガーゼベースの方法と T4 DNA リガーゼベースの方法はいずれも、ターゲット ssDNA とのきれいな接続を生成できますが、ライブラリー調製の効率が低いという点はまだ解決されていません。

ssDNA からの配列ライブラリーの調製を改善するために、我々は、ターミナル デオキシリボヌクレオチジル トランスフェラーゼ (TdT) 支援アデニル酸コネクタ媒介一本鎖 (ss) DNA (TACS) ライゲーションと呼ばれる、ssDNA の効率的なアダプター タグ付けのための技術を開発しました8。 TACS ライゲーションでは、まずリボテイリングと呼ばれるプロセスで TdT を使用してターゲット ssDNA にいくつかのアデニル酸を付加し、続いてリボテイリングされた ssDNA に RNA リガーゼを介したアダプタータグ付けを行います。 ssDNA の 3' 末端をリボテイリングすると、ssDNA が RNA として動作できるようになり、RNA リガーゼの ssDNA ライゲーション効率が大幅に向上します。 したがって、TACS ライゲーションにより、標的 ssDNA8 の 3' 末端の 80% 以上にアダプタータグを付けることが可能になります。 注目すべきことに、TdT とリボヌクレオチドのテーリング反応は 1 ～ 3 ヌクレオチド伸長後に自動阻害され 9、下流の配列解析の中断は最小限に抑えられます。